組培室培養基灌裝機

　　為了盡可能地檢出無菌生產工藝系統中可能會給實際產品造成污染的微生物, 所選用的培養基應盡可能適應廣譜微生物的生長, 包括細菌、霉菌和酵母菌等。驗證試驗前, 可用下述方法來鑒別驗證用培養基的可行性。首先嚴格按照培養基生產商的要求進行配制和滅菌, 然后將無菌培養基分裝至一定數量的無菌小瓶或試管內。同時, 制備好三種微生物[ 枯草芽孢桿菌(B acillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(S tap hy lococcus au reus) 和白色念珠菌(Cand id a a l2bicans) ]的懸浮液, 菌液濃度控制為100～ 1000 個菌/ml。

　　將上述準備好的無菌培養基分成三等份, 且每份至少兩瓶(支) , 分別加入上述菌懸液各0.1 m l。將接有枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的培養基于30～ 35℃下培養, 接有白色念珠菌的培養基于20～25℃下培養。如果在7 d 內, 每種微生物培養基均至少有50% 長菌, 則認為該培養基可用于無菌工藝驗證試驗。實踐證明, 營養肉湯培養基或大豆胰蛋白胨液體培養基( soybean2casein digest medium ) 均適用于培養基灌裝試驗。

　　新建的或生產工藝進行過重大更改后的無菌工藝生產線, 必須經至少連續三批合格的培養基灌裝試驗后方可證明被驗證工藝的可靠性。常規生產條件下的再驗證頻率, 每年至少兩次,每次至少灌裝一批。由于不同時間的氣候狀態不同, 務必考慮對實際生產操作的每個班次進行培養基灌裝試驗。如果因培養基灌裝試驗不合格而重新灌裝時, 灌裝時間(班次) 要與初始灌裝的時間(班次) 相同。

　　一般來說, 每只容器的灌裝體積不得少于其容積的三分之一 , 這樣才能保證有足夠數量的培養基與容器的內表面充分接觸并且易于觀察到微生物的生長狀況。確定培養基的灌裝數量時須考慮以下兩個主要因素。一是應符合統計學要求, 即在95% 的置信限至少能檢出千分之一的污染率; 二是被驗證工藝的日常實際生產批量。因為實際生產批量與無菌工藝操作所持續的時間和灌裝速度密切相關, 而培養基灌裝的持續時間應足以涵蓋實際生產條件下的全部操作, 并且培養基的灌裝數量應能反映出在等于或小于實際生產的灌裝速度下產品及容器所暴露時間“差狀況”。因此, 當某無菌生產線的實際生產批量大于5000 瓶時, 則培養基的灌裝批量不得少于5000 瓶,當無菌生產線的實際生產批量多不超過5000 瓶時, 則按日常大批量灌裝即可。

　　對于產品溶液與培養基溶液配制方法相似的無菌生產線來說, 用培養基替代產品組分完全模擬實際生產時的配液操作進行培養基配制(按培養基生產商的要求)、除菌過濾、并將除菌后的培養基溶液接入一無菌接收罐。對于那些產品溶液配制方法與培養基溶液配制方法不同或是生產粉針劑的無菌生產線來說, 可按照下述方法配制無菌培養基。在潔凈區內, 將事先稱量好的培養基加入一無菌的潔凈配制罐內, 按照培養基生產商的要求配制培養基溶液。在無菌環境下,用無菌管路將配制罐通過一已滅過菌的裝有0. 22μm濾膜(或濾芯) 的過濾器與一無菌的儲罐(儲罐頂部的通氣口應配有0. 2 μm 的疏水性過濾器) 連接起來, 通過加壓或減壓將培養基溶液經除菌過濾后轉移至無菌儲罐內。過濾結束后, 檢查除菌過濾器的完好性, 如果檢查結果合格, 則無菌培養基制備完成。

　　模擬實際灌裝作業進行培養基灌裝。灌裝容器及膠塞應盡可能與常規生產時一致。灌裝時, 好能模擬實際生產時的差狀況, 如設備維修、操作人員的更換等, 以掌握在實際生產條件下產品污染的真實資料。對粉針劑生產線而言, 為了驗證實際生產狀態下的粉末灌裝, 可用適當的無菌粉末模擬灌裝, 再向瓶內注入無菌培養基。用于驗證試驗的粉末要求流動性好、易溶于培養基并且沒有抑菌作用, 如乳糖或甘露醇等; 粉末滅菌可采用輻射滅菌法或環氧乙烷滅菌法; 灌裝時, 每瓶內的粉末量不宜過多, 否則會對培養基溶液的促菌生長造成不良影響, 實踐證明,每5 m l 液體培養基內乳糖含量不宜超過0. 3 g。對水針劑而言, 灌裝培養基后可直接壓塞。對凍干劑而言, 灌裝后, 只進行半壓塞, 模擬實際操作將半壓塞瓶轉移至凍干機內。培養基的冷凍溫度不得低于3℃, 因為溫度過低會使一些微生物死亡或受到損傷, 造成污染水平降低的假象, 就不能如實反映無菌工藝的實際無菌水平。模擬凍干時, 適當進行部分真空和充氮保護模擬(請注意, 真空度不宜過高,否則會引起培養基暴沸; 充氮過量會抑制需氧性微生物的生長)。凍干結束后, 在腔室內全壓塞, 然后卸出并轉移至壓蓋間壓蓋。將壓完蓋的培養基上下顛倒幾次以使培養基與膠塞及整個容器內壁充分接觸。從壓塞至終的培養檢查, 應將盛裝培養基瓶的托盤容器做好標記, 以便對所出現的偏差進行追溯。

　　將壓好蓋的培養基先置于20-25℃培養至少7天，然后在30!35繼續培養7天。培養期間, 可定期對灌裝培養基進行目檢, 記下每次檢出的污染瓶數及出現污染菌的相應托盤編號。檢查時將每瓶培養基在有白色光源的黑色背景下仔細目測。透明、澄清、無混濁的培養基判為無微生物生長; 如培養基混濁或有懸浮的菌絲或菌落, 則需作進一步的微生物生長檢查, 以確定培養基是否真正染菌。對已確定有微生物生長的培養基瓶進行仔細檢查, 看其中是否有破損, 有破損的培養基瓶不得納入終的結果評價。每批灌裝培養基的污染率可按下式計算:

　　污染率% = 污染的培養基瓶數×100/(灌裝總瓶數- 破損瓶數)

　　將培養基瓶中的污染菌在適當的培養基(如大豆胰蛋白胨瓊脂、營養瓊脂等) 上劃線和分離培養。挑取單個菌落進行形態學觀察、革蘭氏染色等初步鑒別。如果需要對培養基灌裝結果作進一步調查, 那么將污染菌鑒別到種, 這對偏差調查將起到非常關鍵的作用。尋找污染菌與其它資料(如環境監控資料) 間的相關性是無菌工藝偏差調查的有效手段。