華石斛組培苗煉苗基質的篩選與優化

　　石斛具有有性生殖和營養生殖 2種繁殖方式，然而受限于溫暖高濕等環境因素，自然繁殖率極低，加之人為過度采摘和生境破壞，野生石斛資源逐年減少且瀕臨滅絕;野生馴化是解決石斛野生資源匱乏的根本途徑。組織培養技術是保存種質資源的重要技術，并已成為蘭花產業種苗生產的一種常規方法，因此通過組織培養快速繁育石斛種苗對其資源保護及可持續利用具有重要意義。但石斛組培苗抗性差，種植存活率較低，必須進行馴化，否則會嚴重影響移栽成活率。除光照、溫度、濕度、通風等環境因子影響其組培苗生長外，栽培基質對石斛馴化起著重要作用，其直接影響到石斛的生長發育和光合作用。國外采用松樹皮做基質已有50多年的歷史，使用松樹皮做基質石斛生物量顯著增加，長勢較好。國內僅對鐵皮(Dendrobium officinale Kimura et Migo)、金釵(Dendrobium nobile Lindl)、霍山(Dendrobium huoshanense)和鼓槌(Dendrobium chrysotoxum Lindl)等少數知名石斛基質方面進行了研究。水苔做基質有利于提高石斛移栽初期存活率[4];水苔與樹皮結合可作為石斛的煉苗基質，使用苔蘚或木屑作基質也有同樣的效果，并且基質的不同成分及配比對鐵皮石斛的存活率和生長量影響顯著。組培苗基質配制及處理不當會導致種苗存活率低，其中基質的理化性質起決定性作用，基質通過影響根系氣、水的交換，進而影響石斛莖葉的生長，因此，栽培基質要保證具有良好的保水性和通風透氣性。

　　華石斛(Dendrobium sinense)是海南特有蘭科植物，自然分布于海南島中西部海拔1000 m以上的高山云霧林或山地雨林中;同時也是一種傳統的黎藥，因全草富含芪類、聯芐類等多類化合物，具有良好的抗菌、抗腫瘤活性。華石斛在自然條件下結實率低，種子萌發成苗極為困難，華石斛野生種群數量不斷減少，目前已處于瀕危狀態?；|對石斛移栽成活和生長影響顯著，已研究結果表明，水苔保水和透氣性均較好，而水苔和樹皮結合又可促進石斛生長健壯、葉色濃綠，有利于組培苗存活和萌發新根、新芽。但基質用量、緊實度等影響基質保水及通氣性的指標，造成水苔基質過濕和樹皮基質保水不夠等現象，在生產上十分常見?；|透氣性和保水性矛盾，這可能與用量或基質搭配有關。本研究設計4種基質處理，通過對各基質的理化性質進行分析及其對華石斛組培苗生長指標的影響，以期篩選出適宜華石斛組培苗的煉苗基質。擬解決如下問題：(1)探索基質配比與華石斛組培苗煉苗成活率的關系;(2)研究基質配比對華石斛組培苗煉苗期生長情況的影響;(3)華石斛組培苗煉苗期基質的優化篩選。研究結果為華石斛組培苗對不同基質的適應性研究提供參考，為華石斛的規?；a提供理論依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 植物材料 華石斛組培苗：選取4片葉(葉色正常)、2～3條根(根長2～3 cm)、無污染的健康苗。

　　1.1.2 試驗區概況 本研究于2017年2—12月在海南省霸王嶺自然保護區(北緯 19°5′57″，東經109°10′32″;海拔978 m)的塑料大棚內進行。山泉水pH 6.0，采用溫濕度自動記錄儀LWS-Ⅱ測得環境因子如下：溫度18.3～35.0 ℃(平均23.4 ℃)，濕度52.4%～100%(平均94.9%，夜間100%)，光照度 0～18.4 klx(白天平均 3.4 klx)，風速 0～3.7 m/s。

　　1.2 方法

　　1.2.1 試驗設計 本研究設計4種基質處理進行煉苗試驗(表1)，所有基質在種植前進行殺菌處理。

　　表1 華石斛組培苗的基質處理

　　Tab. 1 Substrate treatment for D. sinense tissue culture

　　1.2.2 試驗處理 首先，把種植好的組培苗放置于75%的遮陽網下7 d，組培苗不噴水(溫度持續較高時進行少量葉面噴霧)，刺激其生根，初步適應外界環境。1周后，以噴霧形式對組培苗補充少量水分，逐漸增加基質含水量，使組培苗逐步適應大棚環境，每隔7 d對葉面噴施稀釋3000倍的花多多高磷肥(N∶P∶K=9∶45∶15)，增加組培苗抗性，促進石斛生根與萌芽。種植1個月后，每隔7 d噴施稀釋3000倍的高氮肥(N∶P∶K=30∶10∶10)，促進石斛進行營養生長。7～10 d噴1次殺菌劑，多種殺菌劑交替使用，并進行石斛常見病蟲害防治和及時清理病株。每個處理設置3盤苗，每盤30叢，采用隨機區組排列。

　　1.2.3 指標的測定 (1)基質理化性質的測定：采用飽和重力排水法測定基質的孔隙度和氣水比;使用pH計測定基質的pH。

　　(2)華石斛苗生長指標的測定：每隔1周統計組培苗的存活率和新芽率，存活率=存活叢數/總叢數×100%，新芽率=新芽叢數/總叢數×100%;每個處理隨機取5叢，使用游標卡尺測定組培苗莖長和莖粗;處理2個月后，華石斛苗的生長基本穩定，每個處理隨機取3叢測定壯苗指標，采用烘干至恒重法測其地上部和地下部干重，計算地上部莖葉含水量和壯苗指數，壯苗指數=(莖粗/莖長+地下部干重/地上部干重)×全株干重;5個月后各處理的植株葉片差異顯著，測其功能葉的葉長、葉寬和葉面積。

　　(3)華石斛苗光合指標的測定：處理2個月后，選取華石斛組培苗的功能葉，用SPAD-502Plus測定葉綠素相對含量，5次重復，取其平均值;在晴朗天氣的上午9：00—11：30使用Yaxin-1101光合測定儀測定凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導度和胞間CO2濃度，每個指標做3個重復，取其平均值。

　　1.3 數據處理

　　采用 SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析(P<0.05)和Duncan多重比較，并對基質的孔隙度與華石斛苗的生長指標作相關性分析。

　　2 結果與分析

　　2.1 不同基質的孔隙度及其對華石斛組培苗存活率的影響

　　不同基質處理的理化性質有所差異，JZ1和JZ3的容重、總孔隙度和氣水比相對較大，且JZ3顯著高于其他處理(表2)。JZ1與CK相比，加入樹皮后容重、孔隙度和氣水比均高于CK處理;CK和JZ2的pH顯著高于JZ1和JZ3，但均呈弱酸性，適宜華石斛生長。種植2個月后，華石斛苗生長情況基本穩定，JZ3存活率最高，達56.3%，CK、JZ1、JZ2分別為21.0%、26.7%和20.3%，存活率較低;JZ3的新芽率顯著高于其他3種基質，達39.0%。并且基質的總孔隙度(0.98**)、持水孔隙度(0.98**)、通氣孔隙度(0.98**)和氣水比(0.90**)均與存活率呈極顯著相關關系。

　　表2 基質的孔隙度與組培苗存活率的相關性分析

　　注：同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

　　2.2 不同基質對華石斛苗形態指標的影響

　　不同基質處理對華石斛組培苗生長指標有較大差異(圖1)。2個月后，JZ2和JZ3的莖長增長量和鮮重增長量顯著高于CK和JZ1，其中JZ3的處理最高;CK的莖粗相對增長量顯著低于其他3個處理。生長 5個月后，各基質處理華石斛苗葉片變化較為明顯，CK和JZ1葉片呈細長狀;JZ2和JZ3葉片較寬，生長良好，葉面積增長量顯著高于CK和JZ1處理(圖2);其中JZ3葉面積增長量為最高，達到63.2%。

　　2.3 不同基質處理對華石斛組培苗壯苗指數的影響

　　不同基質處理對華石斛組培苗壯苗程度的影響有所差異(表3)。除莖粗外，JZ1與CK相比各指標差異均不顯著，JZ3的莖長顯著高于其他3個處理;JZ1、JZ2、JZ3的莖粗顯著高于CK;從地上部干重、地下部干重和壯苗指數來看，JZ2和JZ3顯著高于CK和JZ1，壯苗指數達0.015和0.016，并且基質的總孔隙度(0.65*)、持水孔隙度(0.66*)、通氣孔隙度(0.64*)均與壯苗指數呈顯著相關關系，壯苗指數與氣水比(0.5)呈正相關。表明組培苗生長需要一定的空間，并且基質太少、失水過快不能起到保濕效果，不利于組培苗生長。

　　2.4 不同基質處理下華石斛組培苗的光合生理

　　圖1 不同基質處理華石斛組培苗2個月的生長量變化

　　不同的基質處理對華石斛組培苗的光合指標的影響有較大差異(表4)。各處理的氣孔導度無顯著差異;JZ2和 JZ3的胞間 CO2濃度顯著高于CK和JZ1;JZ3的蒸騰速率顯著高于CK和JZ1;JZ1和JZ3的葉綠素相對含量顯著高于CK和JZ2，達32.3和34.1，其中CK為最低;JZ3的凈光合速率顯著高于其他 3個處理，達到 7.806 μmol/(m2·s)。

　　圖2 華石斛小苗5個月的生長變化量

　　表3 不同基質下華石斛組培苗的壯苗指標

　　注：同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

　　表4 不同基質下華石斛組培苗的光合生理指標

　　注：同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。

　　3 討論

　　3.1 基質特性對華石斛組培苗的影響

　　長期以來，移栽成活率低一直是困擾石斛規?；a的“瓶頸”。栽培基質是基礎，種苗質量是關鍵，基質是石斛組培苗煉苗初期存活的重要因子，采用疏水透氣保水的栽培基質可提高霍山、鼓槌等石斛的種植成活率，基質的選擇是無土栽培成敗的關鍵。石斛長新根和新芽需要基質保水能力好，根數和新芽的生長量主要依靠基質中的水分和養分，幫助石斛快速恢復生長。華石斛氣生根、附生和喜溫暖高濕的特性使其對基質透氣性、保水和疏水性要求較高。樹皮能顯著提高鐵皮石斛的鮮質量和株高等生長指標，水苔可顯著提高鐵皮石斛光合色素的合成，從而提高葉片的光合作用。本研究結果顯示，用水苔作為基質有利于華石斛組培苗生根、長新芽，可作為組培苗生長所需基質，其中用水苔在5 cm透明塑料杯種植為最佳種植方式。但水苔的處理不同，其透氣性和保水性有所差異，如水苔中加入少量樹皮，可達到增加孔隙度和透氣的作用，從而通過影響根系的水分吸收和透氣性影響石斛存活率;用105孔穴盤種植，水苔用量較少，且過于緊實，保水和透氣性低于5 cm透明塑料杯。水苔在透氣、透水方面存在明顯不足，而且容易爛根和蟲害入侵，這可能是限制華石斛組培苗成活率的主要原因，因此華石斛煉苗基質在既保水又透氣方面還有待進一步改善。

　　3.2 基質配比對華石斛組培苗形態指標的影響

　　基質為石斛提供水分、養分和保證根系氣體交換，進而影響鐵皮石斛的生物量。華石斛在2個月內葉片無明顯變化，但莖長、莖粗和鮮重增長量較為明顯，并且各處理間差異顯著。對比發現，基質通透性高，則莖粗增加量較大;基質用量較大保水性較好，莖長和鮮重顯著增加。水分脅迫會導致鐵皮石斛葉片光反應能力降低，抑制葉綠素的合成。5個月后葉片差異顯著，CK和JZ1處理差異不顯著，葉片均呈細長狀，葉寬和葉長增長量均顯著小于JZ3處理，說明CK和JZ1保水性和透氣性稍差于JZ3，根部吸收水分不穩定、根系透氣性差，導致植株生長不良，葉面積增加量相對較少。葉片是植物進行光合作用的主要器官，葉綠素含量是反映植物光合能力和健康狀態的重要指標[23]，水分脅迫直接導致碧玉蘭葉片的葉綠素含量降低，葉面積較小和葉片的非正常生長也會導致植株葉綠素含量和凈光合速率較低。JZ2的葉寬增長量明顯高于葉長，且基質透氣性高于CK，但其保水性與CK無明顯差異;JZ3與CK相比，增加了水苔的用量，葉長和葉寬同步增加，生長正常;JZ2與 JZ3相比水苔用量較少，說明JZ2用量較少，基質保水性方面稍弱于 JZ3，因此 JZ2可在保證透氣性的基礎上增加水苔用量，保證石斛的正常生長。

　　3.3 基質配比對華石斛組培苗物質累積和壯苗指標的影響

　　植株的生物量不僅反映了植株對水分、營養的吸收能力，還反映了植株的健康水平。石斛光合作用碳同化具備兼性 CAM植物的特征，大都生長緩慢，低光合作用能力是石斛生長緩慢的重要原因。光合作用直接反映作物的生長狀況，其很大程度上影響金釵石斛的生長速度，根系的水、氣交換不良，植株生長不良，導致光合速率的降低;凈光合速率代表植物物質累積的能力，凈光合速率降低導致植株物質積累較少，壯苗指數較低。本研究結果表明，不同的基質處理對華石斛組培苗生長狀態有明顯差異。2個月后CK和JZ1的莖長和莖粗增加不明顯，遠低于JZ2和JZ3，進而導致鮮重降低;JZ3的葉片深綠肥厚，表現為較強的光合作用能力，鮮重和壯苗指數較大。

　　綜上所述，在華石斛組培苗煉苗期間，以5 cm透明塑料杯裝16.3 g水苔作基質進行種植，華石斛組培苗存活率較高，生長指標和光合指標反應較好，可作為華石斛大棚煉苗的優良基質。由于組培苗生長緩慢、抗逆性差等原因，因此要提高組培苗存活率，必須提高組培苗的抗性。在如何提高華石斛組培苗的抗逆性、改善基質保水透氣性等方面，仍需做進一步的研究。